QuantStudio™ 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。請(qǐng)注意，本指南為通用操作流程，在進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)務(wù)必詳細(xì)閱讀儀器和試劑的使用說(shuō)明書(shū)，并嚴(yán)格遵守您所在實(shí)驗(yàn)室的安全規(guī)范。

    一、賽默飛QuantStudio 3 qPCR系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

    儀器操作與運(yùn)行程序

    1、啟動(dòng)軟件：

    雙擊桌面上的“QuantStudio™ Design & Analysis Software"圖標(biāo)啟動(dòng)軟件。

    2、創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)：

    點(diǎn)擊 “New Experiment" 或 “Create New"。

    實(shí)驗(yàn)類(lèi)型： 選擇 “Quantitation (標(biāo)準(zhǔn)曲線定量)"， “Comparative Ct (ΔΔCt法)"， “Melt Curve (熔解曲線)" 等，根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇。

    檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)： 選擇 “SYBR Green" 或 “TaqMan Probe"。

    模板選擇： 可以選擇空白模板或從已有實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入板布局。

    3、設(shè)置板布局：

    在軟件界面顯示的虛擬96孔板上，用鼠標(biāo)選中孔位。

    在右側(cè)屬性欄中，為每個(gè)孔或一組孔定義：

    Sample Name（樣品名稱(chēng)）： 如 Sample1, Control 等。

    Task（任務(wù)）： Unknown（未知樣品）, Standard（標(biāo)準(zhǔn)品）, NTC（無(wú)模板對(duì)照）等。

    Reporter（熒光染料）： 通常是FAM（SYBR Green或TaqMan探針），如果您使用多通道檢測(cè)，還需選擇其他染料如VIC, ROX等。

    Quencher（淬滅基團(tuán)）： 軟件通常會(huì)自動(dòng)匹配，如MGB/NBQ。

    Quantity（濃度）： 僅對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）需要輸入已知濃度，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    4、編輯運(yùn)行程序：

    點(diǎn)擊 “Assign Targets & Samples" 后，進(jìn)入 “Run Method" 界面。

    點(diǎn)擊 “Edit" 編輯熱循環(huán)程序。一個(gè)典型的qPCR程序包含以下步驟：

    階段1：預(yù)變性/UNG酶孵育（可選）

    目的：激活熱啟動(dòng)酶，或使用UNG酶防止殘留污染。

    條件：50°C for 2 min (UNG酶作用)， 95°C for 2-10 min（酶激活）。

    階段2：PCR循環(huán)（40-45個(gè)循環(huán)）

    變性： 95°C for 5-15 seconds。

    退火/延伸： 60°C for 30-60 seconds（在此步驟采集熒光信號(hào)）。

    注意： 退火溫度和時(shí)間需根據(jù)您的引物和預(yù)混液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于SYBR Green法，通常在退火/延伸結(jié)束時(shí)采集信號(hào)。

    階段3：熔解曲線分析（SYBR Green法）

    目的：確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

    條件：95°C for 15 seconds -> 60°C for 1 min -> 緩慢升溫至95°C（例如，每升高0.3°C采集一次熒光信號(hào)）。

    5、運(yùn)行實(shí)驗(yàn)：

    程序設(shè)置完成后，點(diǎn)擊 “Start Run" 或 “Run"。

    軟件會(huì)提示您放置反應(yīng)板。打開(kāi)儀器機(jī)蓋，將反應(yīng)板放入樣品槽，確保板子方向正確（A1孔在左上角），然后關(guān)閉機(jī)蓋。

    在彈出窗口中確認(rèn)板子位置，點(diǎn)擊 “OK" 開(kāi)始運(yùn)行。

    軟件會(huì)實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增曲線和反應(yīng)進(jìn)度。

    二、賽默飛QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析與關(guān)機(jī)

    1、數(shù)據(jù)分析：

    運(yùn)行結(jié)束后，軟件會(huì)自動(dòng)跳轉(zhuǎn)到分析界面。

    設(shè)置基線閾值和Ct值： 軟件通常會(huì)自動(dòng)設(shè)置，但您可能需要手動(dòng)調(diào)整基線范圍（Baseline）和閾值線（Threshold），以確保所有擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算準(zhǔn)確。

    查看結(jié)果： 軟件會(huì)給出每個(gè)孔的Ct值。您可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型查看結(jié)果：

    標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 軟件會(huì)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并自動(dòng)計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù)。

    ΔΔCt法： 軟件可幫助計(jì)算相對(duì)于內(nèi)參基因和對(duì)照組的基因表達(dá)相對(duì)倍數(shù)。

    熔解曲線： 查看熔解峰是否為單一尖銳峰，以確認(rèn)擴(kuò)增特異性。

    導(dǎo)出數(shù)據(jù)： 可以將結(jié)果導(dǎo)出為Excel或CSV格式進(jìn)行進(jìn)一步處理。

    2、關(guān)機(jī)：

    數(shù)據(jù)分析完成后，保存實(shí)驗(yàn)文件。

    退出QuantStudio軟件。

    關(guān)閉電腦。

    通常情況下，QuantStudio 3主機(jī)無(wú)需關(guān)閉電源，以保持內(nèi)部溫度穩(wěn)定并利于光學(xué)元件的保養(yǎng)。如果長(zhǎng)期不用（如超過(guò)一周），可關(guān)閉主機(jī)背后電源開(kāi)關(guān)。

    清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，妥善處理生物廢棄物。

    三、重要注意事項(xiàng)與日常維護(hù)

    1、避免污染： qPCR極其敏感。配制反應(yīng)液和加模板的區(qū)域應(yīng)分開(kāi)，勤換手套，使用帶濾芯的槍頭。

    2、反應(yīng)體系均一性： 確保反應(yīng)液混合均勻，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)影響熒光信號(hào)的讀取。

    3、程序優(yōu)化： 使用的引物應(yīng)進(jìn)行退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)和引物濃度優(yōu)化。

    4、儀器維護(hù)： 定期用柔軟的濕布清潔儀器表面和樣品槽。如果發(fā)現(xiàn)信號(hào)異常，可運(yùn)行儀器自帶的光學(xué)校準(zhǔn)程序（在軟件工具菜單中）。

    5、ROX參比染料： 某些預(yù)混液需要添加ROX染料作為內(nèi)參校正孔間誤差，請(qǐng)根據(jù)您的預(yù)混液說(shuō)明書(shū)決定是否需要在程序設(shè)置中選擇“ROX"作為被動(dòng)參比染料。