QuantStudio™ 3實時熒光定量PCR系統(tǒng)的標準操作流程。請注意，本指南為通用操作流程，在進行任何實驗前，請務(wù)必詳細閱讀儀器和試劑的使用說明書，并嚴格遵守您所在實驗室的安全規(guī)范。

    一、賽默飛QuantStudio 3 qPCR系統(tǒng)標準操作流程

    儀器操作與運行程序

    1、啟動軟件：

    雙擊桌面上的“QuantStudio™ Design & Analysis Software"圖標啟動軟件。

    2、創(chuàng)建新實驗：

    點擊 “New Experiment" 或 “Create New"。

    實驗類型： 選擇 “Quantitation (標準曲線定量)"， “Comparative Ct (ΔΔCt法)"， “Melt Curve (熔解曲線)" 等，根據(jù)您的實驗?zāi)康倪x擇。

    檢測化學物質(zhì)： 選擇 “SYBR Green" 或 “TaqMan Probe"。

    模板選擇： 可以選擇空白模板或從已有實驗導入板布局。

    3、設(shè)置板布局：

    在軟件界面顯示的虛擬96孔板上，用鼠標選中孔位。

    在右側(cè)屬性欄中，為每個孔或一組孔定義：

    Sample Name（樣品名稱）： 如 Sample1, Control 等。

    Task（任務(wù)）： Unknown（未知樣品）, Standard（標準品）, NTC（無模板對照）等。

    Reporter（熒光染料）： 通常是FAM（SYBR Green或TaqMan探針），如果您使用多通道檢測，還需選擇其他染料如VIC, ROX等。

    Quencher（淬滅基團）： 軟件通常會自動匹配，如MGB/NBQ。

    Quantity（濃度）： 僅對標準品（Standard）需要輸入已知濃度，用于制作標準曲線。

    4、編輯運行程序：

    點擊 “Assign Targets & Samples" 后，進入 “Run Method" 界面。

    點擊 “Edit" 編輯熱循環(huán)程序。一個典型的qPCR程序包含以下步驟：

    階段1：預(yù)變性/UNG酶孵育（可選）

    目的：激活熱啟動酶，或使用UNG酶防止殘留污染。

    條件：50°C for 2 min (UNG酶作用)， 95°C for 2-10 min（酶激活）。

    階段2：PCR循環(huán)（40-45個循環(huán)）

    變性： 95°C for 5-15 seconds。

    退火/延伸： 60°C for 30-60 seconds（在此步驟采集熒光信號）。

    注意： 退火溫度和時間需根據(jù)您的引物和預(yù)混液說明書進行優(yōu)化。對于SYBR Green法，通常在退火/延伸結(jié)束時采集信號。

    階段3：熔解曲線分析（SYBR Green法）

    目的：確認擴增產(chǎn)物的特異性。

    條件：95°C for 15 seconds -> 60°C for 1 min -> 緩慢升溫至95°C（例如，每升高0.3°C采集一次熒光信號）。

    5、運行實驗：

    程序設(shè)置完成后，點擊 “Start Run" 或 “Run"。

    軟件會提示您放置反應(yīng)板。打開儀器機蓋，將反應(yīng)板放入樣品槽，確保板子方向正確（A1孔在左上角），然后關(guān)閉機蓋。

    在彈出窗口中確認板子位置，點擊 “OK" 開始運行。

    軟件會實時顯示擴增曲線和反應(yīng)進度。

    二、賽默飛QuantStudio3實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析與關(guān)機

    1、數(shù)據(jù)分析：

    運行結(jié)束后，軟件會自動跳轉(zhuǎn)到分析界面。

    設(shè)置基線閾值和Ct值： 軟件通常會自動設(shè)置，但您可能需要手動調(diào)整基線范圍（Baseline）和閾值線（Threshold），以確保所有擴增曲線的Ct值計算準確。

    查看結(jié)果： 軟件會給出每個孔的Ct值。您可以根據(jù)實驗類型查看結(jié)果：

    標準曲線法： 軟件會生成標準曲線，并自動計算未知樣品的拷貝數(shù)。

    ΔΔCt法： 軟件可幫助計算相對于內(nèi)參基因和對照組的基因表達相對倍數(shù)。

    熔解曲線： 查看熔解峰是否為單一尖銳峰，以確認擴增特異性。

    導出數(shù)據(jù)： 可以將結(jié)果導出為Excel或CSV格式進行進一步處理。

    2、關(guān)機：

    數(shù)據(jù)分析完成后，保存實驗文件。

    退出QuantStudio軟件。

    關(guān)閉電腦。

    通常情況下，QuantStudio 3主機無需關(guān)閉電源，以保持內(nèi)部溫度穩(wěn)定并利于光學元件的保養(yǎng)。如果長期不用（如超過一周），可關(guān)閉主機背后電源開關(guān)。

    清理實驗臺面，妥善處理生物廢棄物。

    三、重要注意事項與日常維護

    1、避免污染： qPCR極其敏感。配制反應(yīng)液和加模板的區(qū)域應(yīng)分開，勤換手套，使用帶濾芯的槍頭。

    2、反應(yīng)體系均一性： 確保反應(yīng)液混合均勻，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會影響熒光信號的讀取。

    3、程序優(yōu)化： 使用的引物應(yīng)進行退火溫度梯度實驗和引物濃度優(yōu)化。

    4、儀器維護： 定期用柔軟的濕布清潔儀器表面和樣品槽。如果發(fā)現(xiàn)信號異常，可運行儀器自帶的光學校準程序（在軟件工具菜單中）。

    5、ROX參比染料： 某些預(yù)混液需要添加ROX染料作為內(nèi)參校正孔間誤差，請根據(jù)您的預(yù)混液說明書決定是否需要在程序設(shè)置中選擇“ROX"作為被動參比染料。