以下是幾種常見(jiàn)用于熒光 PCR 試劑的染料及其原理：

一、SYBR Green I

原理：SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 小溝特異性結(jié)合的熒光染料。在游離狀態(tài)下，它的熒光信號(hào)相對(duì)較弱，而當(dāng) PCR 反應(yīng)進(jìn)行，隨著引物延伸，新的雙鏈 DNA 不斷合成，SYBR Green I 就會(huì)結(jié)合到雙鏈 DNA 上，熒光強(qiáng)度會(huì)大大增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化就能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 產(chǎn)物量的增加情況。其激發(fā)波長(zhǎng)通常在 497nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng)在 520nm 左右呈現(xiàn)綠色熒光。不過(guò)，它的缺點(diǎn)是特異性稍差，因?yàn)橹灰请p鏈 DNA 它都會(huì)結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號(hào)，所以可能會(huì)受到引物二聚體等非特異性雙鏈 DNA 的干擾，在結(jié)果分析時(shí)需要通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析等手段進(jìn)一步區(qū)分特異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物。

二、TaqMan 探針

原理：TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，其 5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)（比如 FAM 等常見(jiàn)熒光基團(tuán)），3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)（如 TAMRA 等）。在完整的探針狀態(tài)下，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光會(huì)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，使得檢測(cè)不到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)。當(dāng) PCR 反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段，Taq DNA 聚合酶具有 5’→3’外切酶活性，會(huì)沿著模板鏈合成新鏈的同時(shí)，將與模板鏈互補(bǔ)結(jié)合的 TaqMan 探針從 5’端逐步水解切斷，使得報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，F(xiàn)RET 效應(yīng)消失，報(bào)告熒光基團(tuán)就能發(fā)出熒光，熒光信號(hào)強(qiáng)度就會(huì)隨著 PCR 循環(huán)次數(shù)增加而增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) DNA 序列擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

三、分子信標(biāo)（Molecular Beacon）

原理：分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其環(huán)狀部分是與目標(biāo) DNA 序列互補(bǔ)的識(shí)別序列，兩端的臂部序列互補(bǔ)配對(duì)形成莖干結(jié)構(gòu)。在自由狀態(tài)下，由于兩端的熒光基團(tuán)（5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，如 FAM 等，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)，如 DABCYL 等）距離很近，同樣基于 FRET 效應(yīng)，報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光被淬滅。當(dāng) PCR 反應(yīng)體系中有目標(biāo) DNA 存在時(shí)，分子信標(biāo)會(huì)與目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合，莖干結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光得以釋放，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)變化來(lái)反映目標(biāo) DNA 的有無(wú)及含量變化，并且其特異性高，對(duì)單堿基錯(cuò)配也有較好的識(shí)別能力。

四、蝎形引物（Scorpion Primer）

原理：蝎形引物由一個(gè)常規(guī)引物和一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針部分組成，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部是與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性互補(bǔ)的序列，其 5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端連接有淬滅熒光基團(tuán)，且在莖干部分還有一段能與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。在 PCR 反應(yīng)初期，引物參與延伸反應(yīng)合成新鏈，當(dāng)新鏈合成到一定程度后，蝎形引物的探針部分會(huì)與新合成鏈中的互補(bǔ)序列結(jié)合，形成分子內(nèi)雜交，使得發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)產(chǎn)生并隨著 PCR 循環(huán)次數(shù)增多而增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) DNA 的實(shí)時(shí)檢測(cè)，這種方式將引物和探針功能結(jié)合，有助于提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。

五、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）雜交探針

原理：通常使用兩條寡核苷酸探針，一條探針的 5’端標(biāo)記有供體熒光基團(tuán)（如 fluorescein 等），另一條探針的 3’端標(biāo)記有受體熒光基團(tuán)（如 Cy5 等）。在溶液中，兩條探針?lè)謩e獨(dú)立存在時(shí)，供體熒光基團(tuán)在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出的熒光能被檢測(cè)到。當(dāng)兩條探針同時(shí)與目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合，且兩條探針之間的距離合適（一般在 10 - 100 ? 之間）時(shí)，就會(huì)發(fā)生 FRET 現(xiàn)象，供體熒光基團(tuán)將能量傳遞給受體熒光基團(tuán)，使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出特征性熒光，通過(guò)檢測(cè)受體熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)變化來(lái)對(duì)目標(biāo) DNA 進(jìn)行定性和定量分析，這種方法特異性也較好，對(duì)檢測(cè)復(fù)雜樣本中的目標(biāo)序列有優(yōu)勢(shì)。

不同的熒光染料或探針有著各自的特點(diǎn)和適用場(chǎng)景，在實(shí)際的熒光 PCR 實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)具體需求來(lái)選擇應(yīng)用。