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如何使用賽默飛nanodrop紫外分光光度計進行蛋白質(zhì)定量

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   賽默飛nanodrop紫外分光光度計是一種廣泛應用于生物化學、分子生物學等領(lǐng)域的實驗儀器,其通過測量物質(zhì)在紫外光區(qū)的吸收特性來進行定性和定量分析。在蛋白質(zhì)定量方面,紫外分光光度計因其操作簡便、快速且不需要復雜設(shè)備而備受青睞。本文將詳細介紹如何使用賽默飛nanodrop紫外分光光度計進行蛋白質(zhì)定量的步驟和原理。
 
  一、實驗原理
 
  紫外-可見分光光度法基于溶液中物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收。對于蛋白質(zhì)而言,其內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵,這些基團在275-280nm波長范圍內(nèi)具有一個強烈的吸收峰。因此,可以通過測量蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度(A),利用朗伯-比爾定律(A=ebc)來計算蛋白質(zhì)的濃度。其中,A為吸光度,e為摩爾吸光系數(shù),b為光程長度,c為濃度。
 
  二、實驗材料
 
  儀器:TU-1901紫外可見分光光度計、石英比色皿(1cm光程)
 
  試劑:標準蛋白質(zhì)溶液(如牛血清白蛋白BSA,已知濃度)、待測蛋白質(zhì)溶液、0.9%NaCl溶液(作為參比溶液)、雙縮脲試劑(用于其他方法時可選擇)、苯酚試劑(用于其他方法時可選擇)
 
  工具:吸量管、比色管、擦鏡紙等
 
  三、實驗步驟
 
  1.儀器準備
 
  開機預熱:打開紫外分光光度計電源開關(guān),預熱20-30分鐘。
 
  波長設(shè)置:預熱完成后,按GOTOλ鍵,輸入所需的波長(如280nm),按ENTER鍵確認。
 
  2.參比溶液設(shè)置
 
  清洗比色皿:用擦鏡紙輕輕擦拭比色皿的光滑面,確保其干凈無污漬。
 
  參比溶液加入:向比色皿中加入適量的0.9%NaCl溶液,輕輕搖勻后放入光度計凹槽中,蓋好蓋子。
 
  調(diào)零:按ZERO鍵進行調(diào)零操作,確保儀器讀數(shù)準確。
 
  3.標準曲線繪制
 
  溶液稀釋:使用吸量管吸取已知濃度的標準蛋白質(zhì)溶液,加入比色管中,用0.9%NaCl溶液稀釋至不同濃度(如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等)。
 
  吸光度測量:將稀釋后的標準溶液依次加入比色皿中,在280nm波長下測量各溶液的吸光度,并記錄數(shù)據(jù)。
 
  繪制標準曲線:以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。
 
  4.待測樣品測定
 
  樣品準備:將待測蛋白質(zhì)溶液用0.9%NaCl溶液稀釋至適當濃度。
 
  吸光度測量:將稀釋后的待測樣品加入比色皿中,在280nm波長下測量其吸光度。
 
  濃度計算:根據(jù)標準曲線,查找或計算待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。
 
  四、注意事項
 
  儀器預熱:確保儀器預熱足夠時間,以提高測量精度。
 
  比色皿清潔:比色皿應保持干凈,避免劃痕和污漬影響測量。
 
  波長設(shè)置:根據(jù)實驗需要設(shè)置正確的波長,通常為280nm。
 
  參比溶液:參比溶液應與待測溶液具有相似的物理和化學性質(zhì),以減少誤差。
 
  樣品稀釋:待測樣品應稀釋至適當濃度,以避免吸光度超出儀器測量范圍。

TEL:18016231680

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